전통발효식품 제조

미생물의 안전한 보존을 위하여 다양한 방법이 이용되고 있다. 현재 널리 이용 되는 방법으로는 동결 보존법(글리세롤 보존법, 액체질소 보존법), 글라스 비드(Glass beads) 보존법, 파라핀(Paraffin) 보존법, DMSO 보존법, 젤라틴 디스크(Gelatin discs) 보존법, 액체(Liquid) 건조법, 동결 건조법 등이 있다. 국내외 대부분의 미생물자원보존센터는 이들 중 동결 보존법(글리세롤 보존법·액체질소 보존법), 글라스 비드 보존법(-80℃), 파라핀 보존법(4℃), 동결 건조법(4℃) 등을 이용하고 있다.

♣ 보존 원리와 방법

수상에서 생활 반응을 저하시키는 방법은 세 가지다. 첫 번째는 저온 상태로 유지하는 계대배양 보존법이다. 두 번째는 산소 공급을 제한하는 액체 파라핀 중층법, 마지막으로는 증류수·식염수·완충액(Buffer) 등을 사용하여 미생물의 영양분 공급을 제한하는 현탁법이다.

수분을 한정시킨 상태에서 생활 반응을 정지시키는 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째는 수분의 이동을 정지시키는 동결 보존법(-20~-140℃)과 액체 질소 보존법(-150~-196℃)이다. 두 번째는 수분을 완전히 제거한 상태에서 보존하는 동결건조 보존법, 건조제 사용 보존법 및 건조 토사 보존법이다.

♣ 미생물 보존 및 기능 유지 기술

유용 미생물을 보존하고 미생물의 기능을 유지하는 기술은 매년 전 세계에서 신기술이 개발되거나 개량되어 특허 출원되고 있다. 산업적으로 유용한 양조 미생물을 좋지 않은 환경에서 장기간 보존하면 성질이 변하거나 사멸된다. 특히 BT 산업에 사용되는 균주는 형질이 어떤 특정한 균주에 한하여 존재하는 경우가 많아 형질이 퇴화하거나 소멸 또는 사멸하는 빈도가 매우 높다. 생명공학 산업에 유용한 균주를 확보하고 보존하는 것은 매우 중요하다.

♣ 단기 보존법

(1) 계대 배양 보존법

신선한 배지에 미생물을 주기적으로 옮겨주는 전통적인 방법이다. 이식 주기는 미생물의 종류, 배지의 종류, 외부 환경에 따라 다르다. 이 방법을 이용할 경우, 적당한 보존용 배지인지, 이상적인 보존 온도인지, 옮겨주는 주기 빈도는 어떤지 등 몇 가지 조건을 검토하고 결정해야 한다(그림 1-3).

(가) 보존용 배지

미생물의 대사율을 낮게 유지시켜 이식 빈도를 줄이려면 최소배지를 사용하는 것이 좋지만 경우에 따라 복합배지를 사용하여 생리적 특성을 유지하기도 한다. 다만 미생물의 증식이 가속되고 대사산물의 축적이 빨리 일어나므로 배지를 자주 바꿔야 한다.

(나) 보관

상온에서 시험관대에 보존하기도 한다. 건조 위험을 최소화하기 위해 실리콘 마 개나 파라필름을 사용하여 시험관을 플라스틱 통에 넣어두어야 한다. 미생물의 대사 속도를 줄이기 위해 냉장고에 보관(4~10℃)하면 1~2개월 보존이 가능하다

(다) 계대배양 방식

배지 교체 간격은 실험으로 결정한다. 연속적으로 배지를 바꾸면서 균주가 순수 배양되는지를 검사하고 형질 변화에 대해 간략하게 특성 판별이 수행되어야 한다. 이 방법의 단점은 잡균의 오염 가능성이 크다는 점과 표기가 잘못되었을 가능성, 돌연변이 균주를 선별할 가능성, 균주가 손실될 가능성, 보관 장소의 부족 등을 들 수 있다.

또한 보존 기간이 짧아 보통 1~2개월에 한 번씩 계대가 필요해 많은 균주를 취급하기 어렵다. 배양 때는 한천배지를 사용하며, 배양이 끝나면 4~10℃에서 다음 계대 시까지 보존한다.

(2) 미네랄 오일 및 침지 보존법

목적 균주를 한천 사면배지에서 배양한 후, 수분 증발과 산소 공급을 제한하기 위해 살균한 파라핀을 가하여 4~10℃의 저온에서 보존한다. 이 방법은 계대배양 보존법의 변법으로 보존 기간이 계대배양 보존법보다 길다. 멸균한 미네랄 오일(액체 파라핀)에 담그는 간단하고 저렴한 방법으로 몇 년 동안 보관할 수 있다.

오염을 방지하기 위해 미네랄 오일은 170℃ 오븐에서 약 1~2시간 가열하고 살균한다. 이어 사면배지에 배양하고 살균한 미네랄 오일은 적어도 2cm 이상 넣고 냉장고에 바로 세워 보관한다.

(3) 동결 보존법

일반적인 세균(유산균 포함)·효모·곰팡이 등을 글리세롤 보존을 이용해 보존하는 방법으로, 간편하고 비교적 저렴하게 장기간 보존할 수 있다. 동결 보존법은 냉장고의 냉동실(-5~-20℃)에서 균주를 보존한다. 사면배양이나 액체배양을 하고 균체나 균사체를 분주한 다음 얼려 보존한다. 약 6개월에서 2년 보존이 가능하다.

다만 용융 온도에서는 세포가 손상을 입기 때문에 -20℃인 전해질 용액(NaCl 용액 등)이 함유된 경우에는 부적합하다. 보존 온도에 따라 -80℃에 보존하는 글리세롤 보존법과 액체질소에 저장하는 액체질소 보존법으로 구분한다(그림 1-2).

(가) 보존 순서

먼저 적당한 배지와 온도에서 미생물을 배양한다. 이어 20% 글리세롤을 냉동 전용 튜브(Cryoprotective tube)에 1mL씩 분주하여 살균한다. 순수 배양된 균체는 백금이로 긁어(40mg) 살균된 글리세롤에 현탁시키고 초저온 냉동고(-80℃) 또는 액체질소에 보존한다.

평판 배지에서 자라지 않는 균주는 액체 배양을 한 후 원심분리를 하여 상등액은 버리고 균체에 20% 글리세롤을 현탁하여 냉동 전용 튜브에 분주한다. 그리고 초저온 냉동고(-80℃)나 액체질소에 보존한다. 동결 보존법은 다른 방법에 비해 조작이 간편하고 안정되게 형질을 유지하면서 장기간 보존이 가능하다. 동결 보존법은 10% 글리세롤을 사용한다(그림 1-4).

생존율을 조사한 실험에서 담자균류의 생존율이 가장 낮은 것으로 판명되었다. 액체질소 보존법은 균주 보존법 중에서 가장 확실한 방법으로 미국균주보존협회(ATCC)에서 이 방법을 적용하고 있다. 이 방법으로 보존된 균주는 형질 변화 없이 장기간 보존이 가능하다. 다만 보존한 균주를 융해하여 사용했을 때, 재차 이 방법으로 보존하는 것은 피해야 한다.

(4) 건조 보존법

곰팡이의 포자 등을 장기 보존할 때 좋다. 앰풀 안에 건조제를 넣은 후, 균주의 포자를 탈지면 등에 묻혀 건조제와 접촉하지 않도록 넣어 밀봉하면 용기 내에서 건조한 상태가 되어 저온에서 장기간 보존이 가능하다. 포자를 형성한 미생물을 토양이나 실리카겔로 건조시켜 보존할 수 있으며, 유리구슬 같은 불활성 고형 물질의 표면 위에 포자를 건조시켜 보존할 수 있다.

토양이나 실리카겔은 씻어서 뚜껑 달린 시험관에 분주하여 고압 살균한 후, 25℃에서 건조시킨다. 건조 보존법을 이용하면 효소 생성용 곰팡이 포자를 12년간 정상적으로 보존할 수 있다